Страшный сон бактерии: во время транскрипции ДНК новоиспеченная РНК «прилипает» к своей ДНК-матрице, образуя трехцепочную структуру, известную как R-петля. Хотя роль, которую играют в клетке R-петли, неоднозначна и до конца не ясна, их появление не в том месте и не в то время может иметь для клетки катастрофические последствия, приводя к разрывам ДНК, мутациям и гибели клеток.
Новое исследование, опубликованное в журнале Nature Structural & Molecular Biology, описывает, как фермент RapA предотвращает образование R-петли в клетках кишечной палочки и играет важную роль в поддержания стабильности генома клеток. Полученные данные демонстрируют, что при определенных условиях фермент РНК-полимераза (RNAP), ответственный за копирование ДНК в РНК, мог бы бесконтрольно генерировать R-петли, и только своевременное вмешательство белка RapA предотвращает этот внутренний террор.
«Возникновение R-петли, как правило, является плохой новостью для клеток, и у них есть множество избыточных механизмов, препятствующих петлеобразованию», - объясняет Сет Дарст, руководитель лаборатории молекулярной биофизики. «Мы обнаружили, что RapA, белок, который интересовал нас в течение многих лет, и служит одним из таких ключевых защитных механизмов».
Все живые организмы используют RNAP для преобразования ДНК в РНК. Исследователям давно известно, что у бактерий транскрипция начинается, когда RNAP присоединяется к цепи ДНК и запускает процесс после получения «зеленого света» от сигма-белков. Но детали того, как заканчивается транскрипция, все еще неясны. Новые исследования показали, например, что RNAP часто остается прикрепленным к ДНК даже после того, как готовый РНК-транскрипт «сошел с конвейера». Что удерживает полимеразу в точке сборки, не понятно.
В 90-х ученые открыли белок RapA, который явно взаимодействовал с RNAP, но не выполнял очевидной функции. «В то время мы действительно не могли понять, что делает RapA», — признает Дарст. Исследование осталось незаконченным. Лишь спустя четверть века, когда новая исследовательская группа обнаружила, что кишечная палочка, подвергшаяся стрессовым условиям с высоким содержанием соли, не может расти без RapA, интерес Дарста к таинственному белку возродился.
Для изучения того, как RNAP остается прикрепленной к ДНК после прекращения транскрипции и как RapA взаимодействует с ней, ученые задействовали криогенный электронный микроскоп. Они выбрали ДНК с отрицательной сверхспиральностью (закрученной двойной спиралью) поскольку она лучше имитирует естественное состояние бактериальной ДНК, чем линейная ДНК, чаще используемая в структурных исследованиях.
«Наша работа — одна из первых, где в эксперименте используется ДНК, закрученная не в ту сторону», — говорит первый автор исследования Джошуа Брюер, который обосновал и разработал этот эксперимент. «Метод помог нам лучше визуализировать топологическое состояние ДНК, то, как белки перестраиваются и как они взаимодействуют с ДНК».
Исследователи были удивлены, обнаружив, что РНК-полимераза, оставаясь прикрепленной к ДНК после завершения транскрипции, далеко не всегда бездействует. Она может снова инициировать транскрипцию, на этот раз без обычной защиты сигма-белков. В их отсутствии инициация транскрипции приводит к образованию опасных R-петель, если только RapA не вмешается первым и не разомкнет «зажим» RNAP.
«RNAP похожа на большой коготь, который сжимается вокруг ДНК», — образно сравнивает Дарст. «RapA связывает RNAP и ослабляет зажим, так что полимераза отделяется от ДНК до того, как сможет создать R-петли».
Моделирование роли белка RapA в цикле бактериальной транскрипции.
Когда команда ученых подвергла бактерии, искусственно лишенные RapA, стрессовым условиям с повышенным содержанием соли, у микробов выявилась генетическая нестабильность — свидетельство того, что RNAP с большей вероятностью остается прикрепленной к ДНК и образует R-петли.
Ученые выяснили, что, хотя E.coli также обладает хорошо изученным ферментом Rho, способным разрывать R-петли, Rho не может полностью компенсировать отсутствие RapA. «Когда мы выводим из клетки RapA, Rho приходится работать «сверхурочно», за двоих, и он со своими задачами справляется неважно», — говорит Брюер. «Похоже, что в условиях, когда кишечная палочка подвергается солевому стрессу, RapA и Rho становятся основной, а не избыточной гарантией стабильности генома».
Дарст, Брюер и их коллеги подозревают, что белок RapA — или нечто похожее на него (гипотетический «фактор высвобождения RNAP») — присутствует не только в E.coli, но и во всех бактериях и, возможно, в клетках организмов, стоящих на более высоком уровне развития. Обнаружение подобных механизмов может вдохновить на разработку новых стратегий борьбы с заболеваниями, связанными с нестабильностью генома при транскрипции ДНК.
«Вероятно, похожие ферменты выполняют аналогичные функции на всем древе жизни», — заключает Дарст. «Чем больше мы узнаем об этих механизмах, тем больше углубляем наше понимание того, как клетки защищают свои геномы».
Недавно ученые подсчитали число публикаций о кишечной палочке и заявили, что в микробиологии ее роль сильно переоценена.